Citometria a flusso (Citofluorimetro)

Rappresenta un’evoluzione del microscopio. È una tecnica che permette il trasporto (flusso) di cellule incolonnate davanti ad un raggio luminoso. Vari rilevatori poi strategicamente posizionati capteranno la luce diffusa dalla cellula in transito. Simultaneamente è in grado di rilevare la fluorescenza qualora questa fosse presente nel campione. Quindi essenzialmente è un sistema che si basa su due principi:

  1. Diffusione: Con vari rilevatori posti ad angoli diversi (solitamente uno a piccolo angolo circa 1°, ed uno a circa 90°);
  2. Fluorescenza: Rilevazione della fluorescenza emessa da campioni trattati con molecole fluorescenti;

Solitamente la luce che colpisce l’oggetto (in questo caso la cellula in transito), ha destini diversi, infatti una parte viene assorbita dal corpo e trasformata in calore, una parte viene diffusa e una parte viene trasmessa. La luce diffusa, la sola che viene captata dallo strumento,è influenzata da vari fattori quali le caratteristiche fisiche del campione, il tipo di luce incidente e l’angolo di analisi.

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È una tecnica multiparametrica che ci fornisce dunque per ogni campione, per ogni singola cellula numerosi dati (vitalità, dimensioni, complessità, fenotipo, ecc…). Le varie popolazioni cellulari vengono analizzate cellula per cellula. Per fare questo le cellule che compongono il campione vengono ordinate in fila indiana e fatte passare una per volta davanti la fonte luminosa. Ogni cellula quindi darà informazioni sulla propria natura e ogni singolo dato potrà essere interpolato in grafici con quelli derivanti da altre cellule.

Per poter incolonnare le cellule in fila indiana viene utilizzato il sistema della Focalizzazione Idrodinamica in cui le cellule vengono inizialmente poste in un liquido isotonico, successivamente verrà creato un flusso, ad una precisa velocità e pressione, che permetterà l’incolonnamento delle cellule. Questa prima fase è la più importante perché cellule che non si incolonnano bene daranno ovviamente dati falsati perché magari saranno troppo vicine e la luce verrà diffusa inevitabilmente in modo diverso, ma lo strumento non riesce a capire se le cellule sono incolonnate bene o male (dipende dall’operatore).

Una delle principali caratteristiche della citofluorimetria è il fatto che le cellule che vengono analizzate sono cellule in sospensione che vengono fatte passare attraverso una fonte luminosa. Cellule adese non possono essere studiate al citofluorimetro.

La grande varietà di dati deriva da sistemi di rilevamento diversi che sono in grado di darci informazioni diverse che, messe insieme, completano il quadro di analisi. I rilevatori della luce diffusa sono:

  1. Forward scatter: è il rilevatore posto di fronte alla sorgente luminosa. È importante sottolineare che la luce captata non è la luce direttamente frontale (altrimenti misureremo la luce trasmessa), ma la luce che viene diffusa ad un angolo di circa 1°. Proprio per eliminare l’interferenza derivante dalla luce trasmessa, sopra il rilevatore è posto un filtro che impedisce alla luce di raggiungerlo. In questo modo solo la luce diffusa verrà rilevata ed analizzata.

                                           

 

 

Il forward scatter ci dà informazioni circa la grandezza della cellula. Infatti maggiore è la dimensione della cellula che ha attaversato la fonte luminosa e maggiore sarà la luce diffusa frontalmente (a circa 1°), quindi il rilevatore risponderà in maniera diversa in base alla luce che lo colpisce.

  1. Side scatter: è il rilevatore posto a circa 90°. Da informazioni circa la complessità della cellula (numero di organelli, struttura, ecc).

      

 

Scatter plot: Unendo i dati provenienti da foreward scatter e side scatter, possiamo risalire a precise popolazioni cellulari. Lo scatter plot è il grafico ottenuto interpolando i due flussi di dati:

Il terzo grafico sopra non è altro che la risultante della somma dei due grafici di foreward e side scatter:

Tutta l’analisi può inoltre essere ampliata utilizzando la fluorescenza. Il citofluorimetro ha infatti sistemi con i quali è in grado di rilevare la presenza di eventuale fluorescenza (previo trattamento delle cellule con sostanze fluorescenti a meno che le cellule analizzate non siano in grado di emettere autonomamente fluorescenza). Quello che ne viene fuori è un diagramma dettagliato della popolazione cellulare che compone il campione.

  1. Rilevamento della fluorescenza: Le cellule possono essere marcate con particolari fluorofori che risponderanno alla luce che le colpisce emettendo fluorescenza. Il citofluorimetro è dotato infatto di una serie di rilevatori per fluorescenza annessi a specchi dicroici che permettono di selezionare una precisa lunghezza d’onda (o una banda di λ). I rilevatori per la fluorescenza si trovano sul versante dello side scatter. Come sempre la fluorescenza sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di fluoroforo e quindi (se il legame con il target è avvenuto secondo le modalità stabilite dall’operatore) della struttura target dell’anticorpo marcato con fluoroforo.

Il fatto che siano presenti diversi rilevatori per diverse fluorescenze a diversa λ ci permette di aumentare il range di analisi. Esempio:

Two color dot plot: è un grafico in cui vengono analizzate varie popolazioni cellulari che rispondono con diverse emissioni di fluorescenza. È essenziale, al fine di evitare falsi positivi, che i picchi di emissione dei fluorofori utilizzati non si sovrappongano. Compito dell’operatore saraà quello di eliminare/minimizzare/interpretare i falsi positivi. Inoltre dovrà stabilire il range di operatività andando a evidenziare una serie di dati ed escludendo i dati che non servono (lo strumento non riconosce tra cellula e detriti cellulari che verranno comunque conteggiati ma devono essere scartati).

Ogni cellula che passa risponde in modo diverso emettendo fluorescenza ad una determinata λ. In base alla λ rilevata lo strumento collocherà un pallino in un punto del grafico. Ad esempio, nel grafico diviso in 4 quadranti in basso a sx avremo le cellule che non rispondono alla fluorescenza e che quindi non sono state riconosciute dall’anticorpo marcato. In basso a dx avremo quelle cellule che rispondono emettendo fluorescenza sul verde, in alto a sx le cellule che rispondono emettendo fluorescenza nell’arancio, mentre in alto a dx troveremo quelle cellule che hanno legato entrambi gli anticorpi, sia quello che emette nel verde sia quello che emette nell’arancio.

Sorgenti del FACS (citofluorimetro)

Si possono utilizzare molti sorgenti diverse, divisibili in 3 grandi famiglie:

  1. Ad ampio spettro;
  2. Sintonizzabili;
  3. Lunghezze d’onda ben precise (3 diverse lampade). La più utilizzata è in questo caso la lampada a gas Argon che emette a 488nm.

La scelta della sorgente è ovviamente correlata al tipo di campione che si andrà ad analizzare. La lampada ad Argon è la più utilizzata perché possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l’eccitazione di numerosi fluorofori.

Camera di flusso

È la porzione che permette l’incolonnamento delle cellule. L’operatore può scegliere la velocità con la quale fare passare le cellule dalla sorgente luminosa.

Filtri

Numerosi filtri possono anche essere usati in combo per permettere una migliore selezione della luce. Abbiamo filtri diversi che selezionano una singola λ o una banda di λ.

Rilevatori

Sono i convertitori del segnale da luminoso ad elettrico. Vengono eccitati dalla luce che li colpisce e grazie ad un fotomoltiplicatore sono in grado di dare risposte ben precise anche a segnali deboli.

I fototubi sono molto sensibili e vengono posizionati laddove la luce arriva con meno intensità, mentre i fotodiodi sono meno efficienti e quindi vengono posizionati laddove la luce arriva con intensità più alta (frontalmente alla sorgente luminosa).